Quando i barbari (Goti e Longobardi) invasero l'Italia e scesero a Roma, vi distrussero sistematicamente molti monumenti e saccheggiarono molti luoghi, incluse le Catacombe. Impotenti di fronte a tali ripetute devastazioni, verso la fine dell'ottavo e l'inizio del nono secolo, i papi fecero trasferire le reliquie dei martiri e dei santi nelle chiese della città, per ragioni di sicurezza.
Una volta terminata la traslazione delle reliquie, le Catacombe non furono più frequentate, anzi vennero totalmente abbandonate, ad eccezione di quelle di San Sebastiano, San Lorenzo e San Pancrazio. Col passare del tempo, frane e vegetazione ostruirono e nascosero le entrate delle altre catacombe, tanto che se ne persero perfino le tracce. Per tutto il tardo Medioevo non si sapeva neppure dove fossero.
L'esplorazione e lo studio scientifico delle catacombe iniziarono, secoli dopo, con Antonio Bosio (1575-1629), soprannominato il "Colombo della Roma sotterranea". Nel secolo scorso l'esplorazione sistematica delle catacombe, e in particolare di quelle di San Callisto, venne eseguita da Giovanni Battista de Rossi (1822-1894), che è considerato il fondatore e padre della Archeologia Cristiana.
Nel 1930 la Santa Sede, proprietario della Catacomba, ha affidato la custodia delle Catacombe di San Callisto alla Congregazione dei Salesiani di Don Bosco.